Născut în Chipping Norton, Oxfordshire, Anglia, este fiul unei profesoare, Joy Marie Palm, și al unui avocat și profesor, Wentworth Earl Miller II. Tatăl său, bursier la Rhodes, locuia la Oxford în timpul nașterii actorului. Miller are multe origini; tatăl său este jamaican, englez, german și evreu, în timp ce mama sa are origini ruse, franceze, olandeze, siriene și libaneze. Când avea doar un an, familia lui s-a mutat în Park Slope, Brooklyn, New York. Are două surori, Leigh și Gillian. Și-a luat licența la literatura engleză la Universitatea Princeton. În timpul facultății, a cantat în grupul a capella al școlii, care se numea „The Princeton Tiger Tones”. În 2013 a făcut public faptul că este homosexual și a refuzat să onoreze invitația de a participa la Festivalul Internațional de Film de la Sankt Petersburg, în semn de protest față de legislația homofobă din Rusia.
Primul sau rol a fost David din Dinotopia, o mini-serie realizata de ABC. Dupa cateva roluri de televiziune minore, a devenit unul dintre protagonistii binecunoscuti ai filmului Human Stain, interpretand versiunea mai tanara a personajului jucat de Anthony Hopkins. A mai aparut in Buffy, spaima vampirilor intr-un episod numit "Go fish". Miller a devenit și mai celebru în anul 2005, când obține rolul lui Michael Scofield in productia televiziunii Fox Network Prison Break. Aici joacă rolul unui frate iubitor care a creat un plan elaborat pentru a-și ajuta fratele, Lincoln Burrows (Dominic Purcell), să scape de pedeapsa cu moartea după ce a fost acuzat de o crimă pe care nu a comis-o. Interpretarea sa în acest film i-a adus o nominalizare pentru categoria „Best Actor in a Dramatic Series” la Golden Globes în 2005.
Apare in "The Human Stain" (2003), un film regizat de Robert Benton si interpreteaza versiunea mai tanara a personajului jucat de Anthony Hopkins. In film apare alaturi de Nicole Kidman, Gary Sinise si Ed Harris. Filmul pune accent pe chestiuni de rasa, de clasa sociala si identitate. Un an mai tarziu este nominalizat pentru acest rol la premiul Black Reel (categoria Best Actor si Best Breakthrough Performance).
Miller a aparut in 2005 in doua videoclipuri ale cantaretei Mariah Carey ("It's Like That" si "We Belong Toghether"). Cel de-al doilea videoclip a fost numit pe site-ul Entertainment Weekly cel mai sexy videoclip din toate timpurile. Actorul este alergic la caini si pisici si la anumite mancaruri si este fan al serialului "Law and Order". A declarat ca a renuntat la fumat dupa zece ani.
