Mary Barbara Jefford s-a născut pe 26 iulie 1930 în Plymstock, Devon, Anglia. Este fiica lui Elizabeth Mary Ellen (născută Laity) și a lui Percival Francis Jefford. A copilărit în West Country și a frecventat cursurile Weirfield School din Taunton, Somerset. A urmat și cursurile școlii de dicție și artă dramatică, Hartly-Hodder, înainte să studieze la Academia Regală de Artă Dramatică din Londra, unde i s-a decernat Medalia de Aur Bancroft. În 1946 când era încă studentă a obținut roluri mici în piese radiofonice. Debutul pe scenă s-a produs în 1949, când a interpretat rolul Violei din "A douăsprezecea noapte" la Dolphin Theatre din Brighton.
După ce a lucrat timp de un an la teatru, în 1950 a boținut rolul Isabellei în producția lui Peter Brooke "Măsură pentru măsură", la Shakespeare Memorial Company (actuala Royal Shakespeare Company) în Stratford upon Avon, în care a jucat alături de John Gielgud (care l-a interpretat pe Angelo) și Harry Andrews (Vincentio).
Timp de patru ani a continuat să interpreteze roluri principale în piesele lui Shakespeare, apărând alături de mari actori ai acelor timpuri: Anne Bullen în Henric al VIII-lea, alături de Tyrone Guthrie; Calpuria în Iuliu Cezar, alături de Anthony Quale și Michael Langham; Hero, alături de John Gielgud și Peggy Ashcroft; Lady Percy în Henric al IV-lea, alături de John Kidd, Anthony Quayle și Michael Redgrave; Isabel alături de Richard Burton în Henric al V-lea; Desdemona, în Othello, alături de Anthony Quayle; Rosalind, în Cum vă place; Hippolita, în Visul unei nopți de vară; Kate, în Îmblânzirea scorpiei, alături de Keith Michell, și Helena din Troilus și Cressida.
După ce a plecat de la Stratford a jucat alături de Michael Redgrave în "Tiger at the Gates", în West End și pe Broadway, înainte să joace la Teatrul Old Vic. Printre rolurile cele mai importante au fost: Portia, din Neguțătorul din Veneția, Imogen, din Cymbeline; Beatrice, din Mult zgomot pentru nimic; Julia din Cei doi tineri din Verona; Tamora din Titus Andronicus; Lady Anne din Richard al III-lea; Viola din A douăsprezecea noapte; Regina Margaret din Henric al VI-lea, Părțile 1-3; Regan din Regele Lear. În 1978 a interpretat rolul Gertrudei în Hamlet (interpretat de Derek Jacobi).
Jefford a mai jucat la Teatrul din Oxford, unde a interpretat folul Fedrei, în piesa lui Racine.
Alt rol important a fost cel al Volumniei (Coriolanus), unde a jucat alături de Ralph Fiennes, la Londra, New York și Tokyo. În 1976 a jucat în premiera de la Teatrul Olivier, în rolul Zabinei, din piesa Tamerlan cel mare, alături de Albert Finney.
În 2007 a interpretat cu succes rolul Doamnei Higgins (mama lui Henry Higgins) la Royal Theatre din Bath, în piesa Pygmalion de George Bernard Shaw, spectacol transferat la Teatrul Old Vic în mai 2008.
Jefford a avut o serie de apariții și în filme și în producții pentru televiziune. În 1959 a interpretat rolul Ofeliei în adaptarea pentru televiziune a piesei Hamlet. Jefford a avut primul rol important în filme în 1967-rolul lui Molly Bloom din Ulysses, pentru care a primit o nominalizare la British Academy Award. Au urmat apoi roluri precum cel al Magdei Goebbels, în "Hitler: ultimele zece zile" (realizat de Ennio de Concini, în 1973), apoi în producția lui Fellini "E la nave va" în 1983 și "A noua poartă" a lui Roman Polanski, în 1998.
Jefford a avut roluri în producții pentru televiziune - serialul Play for Today - și a apărut, ca invitat special, în mai multe seriale populare, printre care Crimele din Midsommer, Madame Bovary, Inspector Alleyn Mysteries.
În 1965 Jefford a primit Ordinul Imperiului Britanic pentru serviciile aduse teatrului, devenind cea mai tânără actriță care a primit această distincție până la acea dată.
