Marcello Vincenzo Domenico Mastroianni s-a născut pe 28 septembrie 1924 în Fontana Liri, Italia. El a fost fiul Idei (născută Irolle) și al lui Ottone Mastroianni, care deținea un atelier de tâmplărie. A fost nepotul sculptorului Umberto Mastroianni. Marcello Vincenzo Domenico a avut un frate Ruggero Mastroianni. Ruggero a devenit monteur de filme și a montat o serie de filme în care a apărut fratele său Marcello.
După terminarea studiilor liceale, se înscrie la facultatea de Economie și Comerț, dar preferă să frecventeze grupul Centrului Universitar de Teatru din Roma, unde este remarcat de regizorul Luchino Visconti, care îl distribuie, împreună cu Vittorio Gassman, în spectacole de teatru cu piesele "Un tramvai numit dorință" de Tennessee Williams, "Moartea unui comis-voiajor" de Arthur Miller și "Trei surori" de Anton Cehov. Debutează în film în 1947 în "Mizerabilii" (regia: Riccardo Frada), lucrează apoi cu Luciano Emmer ("Fetele din Piața Spania", "Bigamul"), cu Carlo Lizzani ("Cronica amanților săraci") și Giuseppe de Santis ("Zile de dragoste"), dar primele experiențe hotărâtoare le trăiește sub regia lui Luchino Visconti în ''Nopți albe'' și, mai ales, cu Federico Fellini în rolul ziaristului Marcello din epocalul film ''La dolce vita'', care îl consacră în cariera artistică. Fellini descoperă în interpretările lui Marcello Mastroianni pe parcursul colaborării lor (''Opt și jumătate'', ''Cetatea femeilor'', ''Ginger și Fred'') personalitatea intelectualului nehotărât, măcinat de întrebări fără răspuns, chinuit de obsesii și fantasme.
Marcello Mastroianni a murit în urma unui cancer pancreatic pe 19 decembrie 1996 la Paris.
