Ruffalo are radacini italiene, nascut in orasul industrial Kenosha, Wisconsin, este fiul lui Marie Rose, stilista si coafeza, si fiul lui Frank Ruffalo Jr., zugrav. Are doua surori, Tania si Nicole, si un frate, Scott, care a murit in decembrie 2008, impuscat. Ruffalo se descrie ca fiind un "pusti vesel" si este mandru de educatia pe care a primit-o in familia sa numeroasa, de origine italiana.
Si-a petrecut adolescenta in Virginia Beach, Virginia, unde lucra tatal sau. Ruffalo a absolvit Liceul First Colonial. Dupa, el s-a mutat impreuna cu familia sa in San Diego, California si mai tarziu in Los Angeles, California, unde a luat lectii la Stella Adler Conservatory si fondat Orpheus Theatre Company. Alaturi de OTC a scris, a regizat si a jucat intr- o serie de piese si si-a petrecut urmatorii noua ani castigandu-si existenta ca barman.
Ruffalo a avut roluri mici in filme ca The Dentist (1996), comedia Safe men (1998) si western-ul lui Ang Lee, Ride with the Devil (1999). Printr-o norocoasa intalinre cu scenaristul Kenneth Lonergan, Ruffalo incepe sa colaboreze cu acesta si sa apara in diferitele sale piese, inclusiv This is Our Mother (1998), rol care l-a ajutat sa obtina un altul: fratele lui Laura Linney, un pierde-vara, in You Can Count On Me, film nominalizat la Oscar.
A primit recenzii favorabile pentru rolul sau din acest film, primind uneori comparatii cu tanarul Marlon Brando, si a castigat premii la Los Angeles Film Critics Association si la Festivalul de Film de la Montreal. Asta a dus la roluri si mai importante, in filme ca: XX/XY (2002), My Life Without Me (2003), In the Cut, alaturi de Meg Ryan (2003), Eternal Sunshine of the Spotless Mind (2004) si in We Don't Live Here Anymore (2004), film bazat pe 2 nuvele scrise de Andre Dubus.
A jucat alaturi de Tom Cruise, rolul unui detectiv in apreciatul thriller Collateral (2004). A jucat si in comedii romantice ca: View from the Top, 13 Going on 30, Just Like Heaven si Rumor Has It.
In 2006 a jucat in piesa regizata de Clifford Odet, Awake and Sing!, la Teatrul Belasco din New York, rol pentru care a fost nominalizat la Premiile Tony. In martie 2007, interpreteaza in Zodiac, rolul unui detactiv de la omucideri Dave Toschi, care o condus investigatia pentru gasirea si arestarea criminalului in serie Zodiac.
In 2002 Ruffalo a fost diagnosticat cu un tip de tumoare la creier, si s-a operat, tumoarea era benigna, dar cauza in anumite perioade paralizie faciala temporara. S-a vindecat complet de paralizie si a revenit la viata sa activa din lumea filmelor.
Pe 1 decembrie 2008, fratele lui Ruffalo a fost impuscat in cap, in Beverly Hills, raportul politiei descriind crima ca pe o executie. Scott a murit pe data de 8 decembrie 2008.
Politia a arestat doi suspecti. Unul dintre suspecti a declarat ca Scott Ruffalo s-a impuscat singur jucand Ruleta Ruseasca; martorii au fost ulterior eliberati, iar investigatia a continuat.
Este casatorit cu actrita Sunrise Coigney din iunie 2000 si au trei copii: un fiu Keen, nascut in 2001 si doua fete: Bella Noche, nascuta in 2005 si Odette, nascuta in 2007.
