Mathilde Seigner s-a născut la 17.01.1968, în Paris, Franța. Ea face parte dintr-o familie de artiști, ca fiică a unui cunoscut fotograf și a unei jurnaliste. Bunicul ei a fost Louis Seigner (1903–1991), decan al Comediei Franceze, iar mătușa ei a fost actrița Francoise Seigner. Este sora actriței Emmanuelle Seiner și a cântăreței Marie-Amélie Seigner. Mathilde a urmat Cours Florent la Paris, și-a făcut debutul în lungmetrajul Zâmbetul (1994) alături de sora ei mai mare, Emmanuelle, cu un rol secundar în această tragicomedie de Claude Miller. S-a remarcat în al doilea rol al său din filmul de debut al lui Christine Carriere, Rosine. Rolul tinerei mame, care suferă de schimbări de dispoziție și se confruntă cu întoarcerea soțului ei dispărut, i-a adus Premiul Michel Simon, în 1995. Seigner a apărut ca sora unui star de spectacol travestit (interpretat de Johnny Hallyday) în Curățătorie chimică (1997), ca Samantha, nepoliticoasă și sinucigașă, în Frumoasa Venus (1999) de Tonie Marshall. A apărut în filmul de debut al lui Christian Carion, Une hirondelle a fait le printemps în care a interpretat o tânără fată de oraș care visează la o viață la țară alături de Michel Serrault. A fost nominalizată la premiul César, la categoria cea mai bună actriță în rol secundar pentru rolurile ei din filmele Curățătorie chimică și Salonul de cosmetică Vénus beauté. A primit o altă nominalizare la César, în 2001, pentru rolul din comedia neagră a lui Dominik Moll, Harry, un ami qui vous veut du bien, cu Laurent Lucas și Sergi Lopez. În plan personal, Seigner a avut în trecut o relație cu actorul Anthony Delon, fiul lui Alain Delon. Ea locuiește din 2006 cu cameramanul Mathieu Petit, pe care l-a cunoscut în timp ce filma 3 Amis (2007). Din relație a rezultat un fiu, care s-a născut pe 10 august 2007.